новини

През последното десетилетие технологията за генно секвениране се използва широко в изследванията на рака и клиничната практика, превръщайки се във важен инструмент за разкриване на молекулярните характеристики на рака. Напредъкът в молекулярната диагностика и таргетната терапия насърчи развитието на концепции за прецизна терапия на тумори и донесе големи промени в цялата област на диагностиката и лечението на тумори. Генетичното тестване може да се използва за предупреждение на риска от рак, насочване на решенията за лечение и оценка на прогнозата, и е важен инструмент за подобряване на клиничните резултати при пациентите. Тук обобщаваме последните статии, публикувани в CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol и други списания, за да разгледаме приложението на генетичното тестване в диагностиката и лечението на рака.

Соматични мутации и мутации в зародишната линия. Като цяло, ракът се причинява от ДНК мутации, които могат да бъдат наследени от родителите (мутации в зародишната линия) или придобити с възрастта (соматични мутации). Мутациите в зародишната линия присъстват от раждането и мутаторът обикновено носи мутацията в ДНК на всяка клетка в тялото и може да бъде предадена на потомството. Соматичните мутации се придобиват от индивиди в негаметични клетки и обикновено не се предават на потомството. Както мутациите в зародишната линия, така и соматичните мутации могат да разрушат нормалната функционална активност на клетките и да доведат до злокачествена трансформация на клетките. Соматичните мутации са ключов двигател на злокачествените заболявания и най-предсказващият биомаркер в онкологията; въпреки това, приблизително 10 до 20 процента от пациентите с тумори носят мутации в зародишната линия, които значително увеличават риска от рак, а някои от тези мутации са и терапевтични.
Мутация на водача и мутация на пътника. Не всички варианти на ДНК влияят на клетъчната функция; средно са необходими от пет до десет геномни събития, известни като „мутации на водача“, за да се предизвика нормална клетъчна дегенерация. Мутациите на водача често се срещат в гени, тясно свързани с жизнените дейности на клетката, като гени, участващи в регулирането на клетъчния растеж, възстановяването на ДНК, контрола на клетъчния цикъл и други жизнени процеси, и имат потенциал да бъдат използвани като терапевтични цели. Общият брой на мутациите във всеки рак обаче е доста голям, вариращ от няколко хиляди при някои видове рак на гърдата до повече от 100 000 при някои силно вариабилни колоректални и ендометриални ракови заболявания. Повечето мутации нямат или имат ограничено биологично значение, дори ако мутацията се случи в кодиращия регион, такива незначителни мутационни събития се наричат ​​„мутации на пътника“. Ако генен вариант в определен тип тумор предсказва неговия отговор или резистентност към лечение, вариантът се счита за клинично операбилен.
Онкогени и туморни супресорни гени. Гените, които често мутират при рак, могат да бъдат грубо разделени на две категории: онкогени и туморни супресорни гени. В нормалните клетки протеинът, кодиран от онкогените, играе основна роля за насърчаване на клетъчната пролиферация и инхибиране на клетъчната апоптоза, докато протеинът, кодиран от онкосупресорните гени, е отговорен главно за негативното регулиране на клетъчното делене, за да се поддържа нормалната клетъчна функция. В процеса на злокачествена трансформация геномната мутация води до повишаване на онкогенната активност и намаляване или загуба на активността на онкосупресорните гени.
Малка вариация и структурна вариация. Това са двата основни вида мутации в генома. Малките варианти променят ДНК чрез промяна, изтриване или добавяне на малък брой бази, включително вмъкване на база, делеция, изместване на рамката на четене, загуба на стартов кодон, загуба на стоп кодон и др. Структурната вариация е голямо пренареждане на генома, включващо генни сегменти с размер от няколко хиляди бази до по-голямата част от хромозомата, включително промени в броя на генните копия, делеция на хромозоми, дупликация, инверсия или транслокация. Тези мутации могат да причинят намаляване или подобряване на протеиновата функция. В допълнение към промените на ниво отделни гени, геномните сигнатури също са част от клиничните доклади за секвениране. Геномните сигнатури могат да се разглеждат като сложни модели на малки и/или структурни вариации, включително туморен мутационен товар (TMB), микросателитна нестабилност (MSI) и хомоложни рекомбинационни дефекти.

Клонални мутации и субклонални мутации. Клоналните мутации присъстват във всички туморни клетки, присъстват при поставяне на диагнозата и остават налични след напредъка на лечението. Следователно, клоналните мутации имат потенциал да бъдат използвани като терапевтични цели за тумора. Субклоналните мутации присъстват само в подгрупа от ракови клетки и могат да бъдат открити в началото на диагнозата, но изчезват с последващ рецидив или се появяват едва след лечение. Хетерогенността на рака се отнася до наличието на множество субклонални мутации в един рак. Важно е да се отбележи, че по-голямата част от клинично значимите драйверни мутации във всички често срещани видове рак са клонални мутации и остават стабилни по време на прогресията на рака. Резистентността, която често се медиира от субклонове, може да не бъде открита по време на диагнозата, но се появява, когато рецидивира след лечение.

Традиционната техника FISH или клетъчен кариотип се използва за откриване на промени на хромозомно ниво. FISH може да се използва за откриване на генни сливания, делеции и амплификации и се счита за „златен стандарт“ за откриване на такива варианти, с висока точност и чувствителност, но ограничена производителност. При някои хематологични злокачествени заболявания, особено остра левкемия, кариотипизирането все още се използва за насочване на диагнозата и прогнозата, но тази техника постепенно се заменя от целенасочени молекулярни анализи като FISH, WGS и NGS.
Промените в отделни гени могат да бъдат открити чрез PCR, както в реално време, така и чрез дигитална капкова PCR. Тези техники имат висока чувствителност, особено подходящи са за откриване и наблюдение на малки остатъчни лезии и могат да получат резултати за относително кратко време. Недостатъкът е, че обхватът на откриване е ограничен (обикновено откриват мутации само в един или няколко гена), а възможността за множество тестове е ограничена.
Имунохистохимията (IHC) е инструмент за мониторинг на базата на протеини, който обикновено се използва за откриване на експресията на биомаркери като ERBB2 (HER2) и естрогенни рецептори. IHC може да се използва и за откриване на специфични мутирали протеини (като BRAF V600E) и специфични генни сливания (като ALK сливания). Предимството на IHC е, че може лесно да се интегрира в рутинния процес на тъканен анализ, така че може да се комбинира с други тестове. Освен това, IHC може да предостави информация за субклетъчната локализация на протеини. Недостатъците са ограничена мащабируемост и високи организационни изисквания.
Секвениране от второ поколение (NGS) NGS използва високопроизводителни техники за паралелно секвениране за откриване на вариации на ниво ДНК и/или РНК. Тази техника може да се използва за секвениране както на целия геном (WGS), така и на интересуващите ни генни региони. WGS предоставя най-изчерпателната информация за геномните мутации, но има много пречки пред клиничното му приложение, включително необходимостта от пресни проби от туморна тъкан (WGS все още не е подходящ за анализ на проби, имобилизирани с формалин) и високата цена.
Целевото NGS секвениране включва секвениране на цели екзони и панел с целеви гени. Тези тестове обогатяват интересуващите ни региони чрез ДНК сонди или PCR амплификация, като по този начин ограничават необходимото количество секвениране (целият екзом съставлява 1 до 2 процента от генома и дори големи панели, съдържащи 500 гена, съставляват само 0,1 процента от генома). Въпреки че секвенирането на цели екзони се представя добре във фиксирани с формалин тъкани, цената му остава висока. Комбинациите от целеви гени са относително икономични и позволяват гъвкавост при избора на гени за тестване. Освен това, циркулиращата свободна ДНК (cfDNA) се очертава като нова опция за геномен анализ на пациенти с рак, известна като течни биопсии. Както раковите клетки, така и нормалните клетки могат да освобождават ДНК в кръвния поток, а ДНК, отделена от раковите клетки, се нарича циркулираща туморна ДНК (ctDNA), която може да бъде анализирана за откриване на потенциални мутации в туморните клетки.
Изборът на тест зависи от специфичния клиничен проблем, който трябва да бъде решен. Повечето от биомаркерите, свързани с одобрените терапии, могат да бъдат открити чрез FISH, IHC и PCR техники. Тези методи са разумни за откриване на малки количества биомаркери, но те не подобряват ефективността на откриване с увеличаване на производителността и ако бъдат открити твърде много биомаркери, може да няма достатъчно тъкан за откриване. При някои специфични видове рак, като рак на белия дроб, където тъканните проби са трудни за получаване и има множество биомаркери за тестване, използването на NGS е по-добър избор. В заключение, изборът на анализ зависи от броя на биомаркерите, които ще бъдат тествани за всеки пациент, и броя на пациентите, които ще бъдат тествани за биомаркера. В някои случаи използването на IHC/FISH е достатъчно, особено когато целта е идентифицирана, като например откриване на естрогенни рецептори, прогестеронови рецептори и ERBB2 при пациенти с рак на гърдата. Ако се изисква по-цялостно проучване на геномни мутации и търсене на потенциални терапевтични цели, NGS е по-организиран и рентабилен. Освен това, NGS може да се разглежда в случаите, когато резултатите от IHC/FISH са двусмислени или неубедителни.

Различни насоки дават насоки за това кои пациенти трябва да отговарят на условията за генетично изследване. През 2020 г. Работната група по прецизна медицина на ESMO издаде първите препоръки за NGS тестване за пациенти с напреднал рак, препоръчвайки рутинно NGS тестване за проби от тумори на напреднал несквамозен недребноклетъчен рак на белия дроб, рак на простатата, колоректален рак, рак на жлъчните пътища и рак на яйчниците, а през 2024 г. ESMO актуализира на тази основа, препоръчвайки включването на рак на гърдата и редки тумори. Като стомашно-чревни стромални тумори, саркоми, рак на щитовидната жлеза и рак с неизвестен произход.
През 2022 г. Клиничното становище на ASCO относно соматичното геномно тестване при пациенти с метастатичен или напреднал рак гласи, че ако терапия, свързана с биомаркер, е одобрена при пациенти с метастатични или напреднали солидни тумори, за тези пациенти се препоръчва генетично тестване. Например, геномно тестване трябва да се извърши при пациенти с метастатичен меланом за скрининг на BRAF V600E мутации, тъй като RAF и MEK инхибиторите са одобрени за това показание. Освен това, генетично тестване трябва да се извърши и ако има ясен маркер за резистентност към лекарството, което ще се прилага на пациента. Egfrmab, например, е неефективен при колоректален рак с мутация на KRAS. Когато се обмисля пригодността на пациента за генно секвениране, физическото състояние на пациента, съпътстващите заболявания и стадият на тумора трябва да бъдат интегрирани, тъй като поредицата от стъпки, необходими за геномното секвениране, включително съгласието на пациента, лабораторната обработка и анализа на резултатите от секвенирането, изискват пациентът да има адекватен физически капацитет и продължителност на живота.
В допълнение към соматичните мутации, някои видове рак трябва да бъдат тествани и за гени на зародишната линия. Тестването за мутации на зародишната линия може да повлияе на решенията за лечение на ракови заболявания, като например мутации в BRCA1 и BRCA2 при рак на гърдата, яйчниците, простатата и панкреаса. Мутациите на зародишната линия могат също да имат значение за бъдещ скрининг и превенция на рака при пациентите. Пациентите, които са потенциално подходящи за изследване за мутации на зародишната линия, трябва да отговарят на определени условия, които включват фактори като фамилна анамнеза за рак, възраст при поставяне на диагнозата и вид рак. Въпреки това, много пациенти (до 50%), носещи патогенни мутации в зародишната линия, не отговарят на традиционните критерии за изследване за мутации на зародишната линия въз основа на фамилна анамнеза. Следователно, за да се увеличи максимално идентифицирането на носителите на мутации, Националната всеобхватна мрежа за борба с рака (NCCN) препоръчва всички или повечето пациенти с рак на гърдата, яйчниците, ендометриума, панкреаса, колоректалния рак или простатата да бъдат тествани за мутации на зародишната линия.
Що се отнася до времето за генетично изследване, тъй като по-голямата част от клинично значимите драйверни мутации са клонални и относително стабилни в хода на прогресията на рака, е разумно да се извърши генетично изследване на пациентите по време на диагностициране на напреднал рак. За последващо генетично изследване, особено след молекулярно-таргетирана терапия, ctDNA изследването е по-предпочитано от туморно-тъканната ДНК, тъй като кръвната ДНК може да съдържа ДНК от всички туморни лезии, което е по-благоприятно за получаване на информация за туморната хетерогенност.
Анализът на ctDNA след лечение може да е в състояние да предскаже отговора на тумора към лечението и да идентифицира прогресията на заболяването по-рано от стандартните методи за образна диагностика. Въпреки това, протоколи за използване на тези данни за насочване на решенията за лечение не са установени и анализът на ctDNA не се препоръчва, освен в клинични изпитвания. ctDNA може да се използва и за оценка на малки остатъчни лезии след радикална туморна хирургия. ctDNA тестването след операция е силен предиктор за последваща прогресия на заболяването и може да помогне да се определи дали пациентът ще се възползва от адювантна химиотерапия, но все още не се препоръчва използването на ctDNA извън клинични изпитвания за насочване на решенията за адювантна химиотерапия.

Обработка на данни Първата стъпка в секвенирането на генома е извличането на ДНК от проби на пациенти, подготовката на библиотеки и генерирането на сурови данни за секвениране. Суровите данни изискват допълнителна обработка, включително филтриране на данни с ниско качество, сравняването им с референтния геном, идентифициране на различни видове мутации чрез различни аналитични алгоритми, определяне на ефекта на тези мутации върху транслацията на протеини и филтриране на мутации в зародишната линия.
Анотацията на шофьорския ген е предназначена да разграничи мутациите на шофьорския и пътническия тип. Мутациите на шофьорския тип водят до загуба или засилване на активността на тумор-супресорния ген. Малките варианти, които водят до инактивиране на тумор-супресорните гени, включват безсмислени мутации, мутации с изместване на рамката на изместване и ключови мутации в мястото на сплайсинг, както и по-рядко заличаване на стартов кодон, заличаване на стоп кодон и широк спектър от мутации при вмъкване/делеция на интрон. В допълнение, миссенс мутациите и малките мутации при вмъкване/делеция на интрон също могат да доведат до загуба на активност на тумор-супресорния ген, когато засягат важни функционални домейни. Структурните варианти, които водят до загуба на активност на тумор-супресорния ген, включват частична или пълна делеция на гени и други геномни варианти, които водят до разрушаване на рамката за четене на гени. Малките варианти, които водят до засилена функция на онкогените, включват миссенс мутации и случайни инсерции/делеции на интрони, насочени към важни функционални домейни на протеини. В редки случаи, отрязването на протеини или мутациите в мястото на сплайсинг могат да доведат до активиране на онкогени. Структурните вариации, които водят до активиране на онкогени, включват генно сливане, генно заличаване и генно дублиране.
Клиничната интерпретация на геномните вариации оценява клиничното значение на идентифицираните мутации, т.е. тяхната потенциална диагностична, прогностична или терапевтична стойност. Съществуват няколко системи за класификация, базирани на доказателства, които могат да се използват за насочване на клиничната интерпретация на геномните вариации.
Базата данни за прецизна онкология (OncoKB) на онкологичния център Memorial Sloan-Kettering класифицира генните варианти на четири нива въз основа на тяхната предсказваща стойност за употреба на лекарства: Ниво 1/2, одобрени от FDA или клинично стандартни биомаркери, които предсказват отговора на специфична индикация към одобрено лекарство; Ниво 3, одобрени или неодобрени от FDA биомаркери, които предсказват отговор на нови таргетни лекарства, които са показали обещаващи резултати в клинични изпитвания, и Ниво 4, биомаркери, неодобрени от FDA, които предсказват отговор на нови таргетни лекарства, които са показали убедителни биологични доказателства в клинични изпитвания. Добавена е пета подгрупа, свързана с резистентност към лечение.
Насоките на Американското дружество по молекулярна патология (AMP)/Американското дружество по клинична онкология (ASCO)/Колежа на американските патолози (CAP) за интерпретация на соматичните вариации разделят соматичните вариации на четири категории: Степен I, със силно клинично значение; Степен II, с потенциално клинично значение; Степен III, с неизвестно клинично значение; Степен IV, без известно клинично значение. Само вариантите от степен I и II са ценни за вземане на решения за лечение.
Скалата за клинична оперативност на молекулярните мишени (ESCAT) на ESMO класифицира генните варианти на шест нива: Ниво I, мишени, подходящи за рутинна употреба; Фаза II, мишени, които все още се проучват, вероятно ще бъдат използвани за скрининг на популацията пациенти, които биха могли да се възползват от целевото лекарство, но са необходими повече данни в подкрепа на това. Степен III, мишени генни варианти, които са демонстрирали клинична полза при други видове рак; Степен IV, само мишени генни варианти, подкрепени от предклинични доказателства; В степен V, има доказателства в подкрепа на клиничното значение на насочването към мутацията, но терапията с едно лекарство срещу целта не удължава преживяемостта или може да се приеме комбинирана стратегия за лечение; Степен X, липса на клинична стойност.